Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede

Faculty of Agriculture and Life Sciences

  

arrs logo official NKFIH cimer lead UM univet logo

Madžarsko-slovenski bilateralni projekt

Naslov projekta:
Vpliv hranjenja ličink hibridov sviloprejke (Bombyx mori L.) z listi starih lokalnih madžarskih in slovenskih genotipov murv (Morus alba L.) na razvoj in zdravstveni status ličink

Šifra projekta: N1-0041
Trajanje projekta: 1. 1. 2016 – 31. 12. 2018

Vodji projekta:
Madžarski partner: dr. Rebeka Berčič
Slovenski partner: dr. Andreja Urbanek Krajnc

Nosilni raziskovalni organizaciji:
Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede
Veterinarska univerza Budimpešta

Projekt financirata:

Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije

Nemzeti kutatási fejlesztési és innovációs hivatal

 

Povzetek:

Svila, ki se pridobiva iz zapredka murvine sviloprejke (Bombyx mori L.), je od nekdaj cenjeno naravno vlakno. Ličinke sviloprejke so monofagi, ki se hranijo z listi murve (Morus spp. L., Moraceae). Znanih je več kot 68 vrst murv, med katerimi je bela murva (Morus alba) najprimernejša za hranjenje gosenic murvine sviloprejke. Murva se je skozi tisočletja razširila na široko območje tropskih, subtropskih in zmernih območjih. O nekdanjem svilogojstvu pričajo preostala murvina drevesa v naseljih in pokrajini. Ker se madžarska in slovenska kulturna krajina, posebno v obdobju po drugi svetovni vojni, ni tako korenito spremenila, so se tod ohranile številne večstoletne murve, katerih genotipi so za evropski prostor izjemni, saj odražajo družbeno-ekonomsko in politično zgodovino nekdanje avstro-ogrske monarhije. Hkrati predstavljajo dragocen genetski vir, saj so se skozi stoletja prilagodili tukajšnjim podnebnim razmeram. Vzpostavitev kolekcije in molekulsko vrednotenje teh genotipov bi lahko pomembno prispevalo k trajnostnemu gojenju murv za potrebe naraščajočega povpraševanja po svili, še posebej ekološko pridelani. Podatki o številu starodavnih murv, ki pripadajo rodu M. alba in M. nigra, so na Madžarskem in v Sloveniji nepopolni, saj njihova genetska struktura še ni bila predmet raziskav. Določevanje starih lokalnih murv na podlagi morfološko-fenoloških lastnosti je težavno in nezanesljivo. Na genetsko raznolikost vpliva njihov izvor in med drugim tudi različno izražanje spolov med vrstami in sortami, saj so murve enodomne ali dvodomne rastline. Večina danes gojenih murv v Evropi (Italija, Francija, Bolgarija in Poljska) izvira iz azijskih držav, pretežno iz Indije, Kitajske, Tajske in Japonske. Molekulske analize s pomočjo AFLP markerjev so nekoliko osvetlile njihov izvor. Navedbe o številčnosti starodavnih lokalnih murv v posameznih regijah Madžarske in Slovenije so nepopolne in njihova sistematska pripadnost še nejasna.

Glavne prednostne naloge slovenskega dela predlaganega projekta so vzorčenje, molekulska karakterizacija, ohranjanje in razmnoževanje starih lokalnih genotipov murv iz različnih eko-geografskih regij Madžarske in Slovenije, ki sovpadajo z razvojem svilogojstva v preteklosti. Predhodne molekulske raziskave številnih avtorjev nakazujejo, da bomo s pomočjo molekulski markerjev, AFLP in SSR, potencialno najbolje opredelili genetsko raznolikost murv na Madžarskem in v Sloveniji.

V pet tisoč letih selekcije sviloprejke B. mori za proizvodnjo večjih in kvalitetnejših svilenih zapredkov je le ta postala glede preživetja, hranjenja in razmnoževanja popolnoma odvisna od ljudi. Ob tem so ličinke B. mori postale zelo občutljive na številne dejavnike okolja in dovzetne za mnoge vrste bolezni, zlasti v povezavi s kakovostjo hrane sviloprejk.
Po ustanovitvi zbirke starih lokalnih madžarskih in slovenskih genotipov murv in opisu njihove filogenije bo eden glavnih ciljev predlagane raziskave biokemijska določitev primarnih (sladkorji, beljakovine, aminokisline) in sekundarnih metabolitov (fenoli, askorbat, glutation) v listih starih lokalnih genotipov. Madžarski del projekta je nato osredotočen na preučevanje učinkov hranjenja ličink z murvinim listjem na razvoj in zdravstveno stanje ličink. S kvantitativno metodo bo določena vsebnost različnih bakterij v sviloprejkah brez in s kliničnimi znaki bolezni, pri čemer bo poseben poudarek namenjen morebitni okužbi z mikoplazmo. Razvoj modelnega sistema, ki vključuje B. mori in njene specifične bakterije, bi nam pomagal preučiti učinke osnovnih dejavnikov okolja (temperature, vlažnost, prehrana) na razmnoževanje bakterij in izražanje genov, povezanih s prirojeno odpornostjo insektov. Ob tem bi v zgoraj omenjenem sistemu določili tudi učinek nevraminidaz izbranih bakterij na različna tkiva sviloprejke.

Ob zaključku projekta bodo odbrani in razmnoženi tisti genotipi starih lokalnih sort murv, ki so glede hranilne vrednosti in ugodnega vpliva na zdravstveno stanje sviloprejk najbolj ugodni za trajnostno, ekološko gojenje sviloprejk in proizvodnjo svile. Rezultati predlaganega projekta bodo v veliko korist za ponovno vzpostavitev trajnostnega in ekološko sprejemljivejšega svilogojstva.

Izhodišče problema:

Bakterijske bolezni pomembno vplivajo na učinkovitost gojenja sviloprejk in proizvodnjo svile, vendar več vidikov bakterijskih bolezni sviloprejk (diagnostika, vloga aktivnosti bakterijskih nevraminidaz) ni v celoti raziskanih. Prehrana ima pomembno vlogo pri vitalnosti in imunskem odzivu sviloprejke, vendar pa je malo znanega o vplivih kakovosti krme na odpornost proti bakterijskim boleznim. Naša hipoteza je, da je hranjenje hibridnih ličink sviloprejke z listi izbranih starih lokalnih madžarskih in slovenskih genotipov murv z visoko vsebnostjo nekaterih ključnih primarnih in sekundarnih metabolitov pozitivno vpliva na razvoj, splošno zdravstveno stanje, imunsko odzivnost sviloprejke in proizvodnjo svile. Stari genotipi murv so dragoceni genski viri najbolje prilagojeni specifičnim podnebnim razmeram z značilno kvalitativno in kvantitativno sestavo metabolitov. Informacije o številu ohranjenih starih genotipov murv na Madžarskem in v Sloveniji ter njihova taksonomska razvrstitev na ravni vrste in nižjih taksonomskih nivojev je nezanesljiva in nepopolna. Kooperativno sodelovanje obeh partnerjev bo pripomoglo odgovoriti na ključna vprašanja, ali se stari, lokalni genotipi murv razlikujejo v sestavi primarni in sekundarnih metabolitov, in ali te razlike pomembno vplivajo na razvoj ličink, proizvodnjo svilene niti, in odpornost B. mori na bakterijske bolezni. Študije so lahko tudi odgovor, ali ima aktivnost bakterijske nevraminidaze vpliv na razvoj kliničnih znakov in patoloških lezij.

Cilji projekta so:

1. Kvalitativno in kvantitativno analizirati bakterijske okužbe klinično zdravih in obolelih sviloprejk. Poseben poudarek bo na zaznavanju mikoplazem.
2. Zaznavati aktivnost encima nevraminidaze patogenih bakterij, izoliranih iz B. mori.
3. Na patosistemu B. mori in njenimi specifičnimi bakterijami bomo razviti modelni sistem, na katerem bo možno proučevati učinek krme na bakterijsko namnoževanje, razvoj kliničnih znakov okužbe in izražanje genov, povezanih z imunsko odpornostjo.
4. Vzpostavitev digitalne knjižnice in zemljevida z lokacijami murv.
5. Razmnožiti in ohraniti stare lokalne genotipe murv iz različnih eko-geografskih regij Slovenije in Madžarske, ki so bile v preteklosti povezane s svilogojstvom.
6. S pomočjo molekularnih analiz (AFLP, SSR) razlikovati lokalne slovenske in madžarske lokalne genotipe murv.7. Kvalitativno in kvantitativno analizirati pomembnejše primarne (sladkorji, beljakovine, aminokisline) in sekundarne metabolite (fenoli, askorbat, glutation) v listih različnih lokalnih genotipov murv. Hkrati želimo ugotoviti povezavo med navedenimi metaboliti in aktivnostjo sviloprejk, ki se z njimi hranijo (učinkovitost presnove hranil, rast in preživetje mladih larv, pridelek svile, kvaliteto svilnih niti) ter zdravstvenim statusom larv (odpornost na patogene in okužbe).

Realizacija zastavljenih ciljev v 1. letu:

DP 1 Identifikacija bakterij v zdravih sviloprejkah in sviloprejkah z bolezenskimi znaki: Iz sviloprejk, ki so kazale bolezenske znake smo izolirali bakterije iz rodu Micrococcus sp. in Proteus sp. Razvili smo metode (real-time PCR) za občutljivost in kvantitativno detekcijo nukleinskih kislin izoliranih bakterij. Testirali smo prisotnost mikoplazem z uporabo univerzalnih primerjev konzerviranih regij Mycoplasmataceae, in z metodami sekvenciranja naslednje generacije (next generation sequencing).

DP 2 Raziskave aktivnosti nevraminidaze patogenih bakterij izoliranih iz B. mori: Na podlagi pridobljenega celotnega genoma bakterij Enterococcus in Proteus, ki sta povzročitelja poapnenja smo analizirani gene za nevraminidazo. V genomih izoliranih bakterij nismo določili nevraminidaznih genov. Nadaljne raziskave so v teku.

DP 3 Popis in vzorčenje starih lokalnih genotipov murv: Na podlagi zgodovinskih virov, podatkovnih baz in s sodelovanjem s strokovnjaki s področja botanike in dendrologije v Sloveniji, Madžarskem in Avstriji smo predhodno pridobili podatke o nekaj lokacijah starih murv, ki smo jih preverili na terenu (HU in SI partner). Na Madžarskem smo povzorčili okoli 200 dreves, v Sloveniji okoli 550. Vzpostavili smo herbarij, digitalno knjižnico in zemljevid razširjenosti. Podatki o razširjenosti so na voljo na spletni strani: www.murve.um.si. Pri vzorčenih genotipih smo izvedli morfometrične analize listov. Podatki se bodo v nadaljevanju uporabili za napredne GIS analize.

DP 4 Vegetativno razmnoževanje in ohranjanje murv: Iz pololesenelih potaknjencev vzorčenega materiala smo pridobili sadike z namenom vzpostavitve nasada murv pod vilo Pohorski dvorec, FKBV UM (0.6 ha). Iz razmnoženih genotipov je v teku vzpostavitev eksperimentalnega nasada na Madžarskem.

Genetska analiza lokalnih genotipov murv: Iz mladih listov vzorčenih genotipov smo z metodo CTAB izolirali DNK. Testirali smo 13 različnih mikrosatelitov in pet podpornih uporabili za nadaljne genetske primerjave genotipov.

Pričeli smo z delovnim paketom določanja metabolitov v listih, ki je predviden za drugo projektno leto. Vzpostavili smo metodo za določanje aminokislin v listih.

Rezultati, ki smo jih pridobili v letu 2016 so v postopku statističnega vrednotenja in pripravi znanstvenih objav. V okviru zastavljenega projekta smo do sedaj objavili en znanstveni članek (Ugulin in sod. 2015), eno magistrsko nalogo (Ugulin 2016) in eno diplomsko nalogo (Korez 2016). Ne glede na zamrznitev projekta z madžarske strani z razloga porodniškega dopusta, smo uresničili vse zastavljene cilje oz. delovni načrt prvega leta.

Realizacija hipotez:

H 1: Bakterijski patogeni sviloprejk še niso popolnoma raziskani. V bolezenskem procesu verjetno sodelujejo tudi mikoplazme.Iz hemolimfe sviloprejk, ki smo jih vzorčili pri rejcih v Italiji, smo izolirali Micrococcus sp. in Proteus sp. Genetska karakterizacija sevov je v teku. Doslej v vzorčenih gosenicah mikoplazem nismo odkriti.

H 2: „Pomemben dejavnik pri patogenosti bakterij je encim nevraminidaza.Na podlagi pridobljenega celotnega genoma bakterij Enterococcus in Proteus smo analizirani gene za nevraminidazo. Določitev možne aktivnosti nevraminidaze bakterij, ki smo jih izolirali iz gosenic je v teku.

H 3: „Razvoj gosenic, količina proizvedene svile in odpornost sviloprejke na bakterijske okužbe so odvisni od kakovosti krme. Predvidevamo, da ima hranjenje sviloprejk z listi starih genotipov slovenskih in madžarskih murv pozitiven učinek na razvoj, odpornost in splošno zdravstveno stanje sviloprejk ter proizvodnjo svilene niti.” V listih starih lokalnih genotipov smo analizirali vsebnost skupnih proteinov, skupnih in posameznih fenolov, tiolov in kalcija. Analize aminokislin so v teku. Genotipe z visoko vsebnostjo željenih metabolitov smo odbrali in razmnožili za nadaljne poskuse učinka hranjenja na razvoj sviloprejk.

H 4: „Podatki o pojavljanju, številčnosti in taksonomiji starih genotipov murv so za Slovenijo in Madžarsko nepopolni in nezanesljivi.” Sredi 19.st je bilo na Slovenskem in Avstrijskem Gradiščanskem po pisnih virih skupaj okrog 2 milijona murv. Zadnji pridelovalci so s svilogojstvom končali okoli leta 1960. Podatki o številu preostalih murv so nepopolni. Predvsem so nezanesljivi podatki o razširjenosti črne murve, saj jo pogosto zamenjujemo s temnoplodnimi genotipi bele murve. Do sedaj smo v Sloveniji z zanesljivostjo potrdili samo štiri lokacije črne murve, na Madžarskem preverjamo razširjenost enajstih navedb, katerih lokalitete niso jasno opredeljene s pomočjo satelitskega pozicioniranja GPS. Podatki o razširjenosti objavljamo na spletni strani www.murve.um.si.

H 5: „Stari genotipi murv s specifično sestavo metabolitov so bolje prilagojeni na specifične klimatske razmere in predstavljajo pomembni genski vir.” Dosedanje raziskave metabolitov v listih starih genotipov murv na Goriškem (Ugulin in sod. 2015, Ugulin 2016) so pokazale, da so nekateri genotipi superiorni v vsebnosti ključnih metabolitov. Ti genotipi se bodo uporabili v nadaljnih krmilnih poskusih. Genetska analiza teh genskih virov je v teku.

Pomen:

Raziskovanje bakterijskih bolezni se običajno osredotoča na bolezni višjih vretenčarjev (sesalcev in ptic), precej manj pa je znanega o bakterijskih okužbah in boleznih žuželk, njihovih obrambnih mehanizmih in učinkih okoljskih dejavnikov na proces okužbe.
Pričakujemo, da nam bodo rezultati raziskave ponudili nove informacije o razvoju bakterijskih okužb (tudi vlogo aktivnosti encima nevraminidaze) pri sviloprejki Bombyx mori. Želimo tudi pridobiti čim več podatkov o prehranski vrednosti listov murv, predvsem o njihovi vsebnosti primarnih in sekundarnih metabolitov na razvoj, imunsko in protibakterijsko odpornost sviloprejk. Rezultate bi lahko primerjali s primerljivimi raziskavami pri vretenčarjih, kar bi nam omogočalo nov pogled na odnose med gostitelji, patogeni in okoljem.
Svilogojstvo je pomembna ekonomska panoga na Kitajskem in v Indiji, vendar je dandanes z uporabo antibiotikov, pesticidov in gensko spremenjenih sviloprejk podvžena intenzivnim pridelovalnim metodam, ki destruktivno vplivajo na okolje. Zaradi vedno večjih problemov z intenzivno rejo in urbanizacijo produkcija svile stagnira ali se zmanjšuje, medtem ko je mednarodno povpraševanje po svili vedno večje. V srednji Evropi ima svilogojstvo večstoletno tradicijo, a je zamrlo v drugi polovici 20. stoletja. Rezultati raziskave bi lahko prinesli znanje, ki ga potrebujemo za vzpostavitev vzdržnega ekološkega svilogojstva na našem območju. Poznavanje genske raznolikosti in ohranitev starih lokalnih genotipov v Sloveniji in na Madžarskem je ključno za ohranjanje naravne in kulturne dediščine. Ponovno uvajanje gojenja sviloprejk bi lahko predstavljalo vir dobička posameznikom in popestrilo nabor kmetijskih panog.

Za javnost:

Naravno svilo proizvajajo ličinke sviloprejk. Za proizodnjo svile se po celem svetu goji na milijone sviloprejk, da zadostujejo potrebam ljudi po tej dragoceni tkanini. Bolezni  sviloprejke zmanjšujejo produkcijo svile. Gre za bakterijske okužbe, o katerih pa zaenkrat še ni veliko znanega. Sviloprejke se hranijo z listi belih murv. Murve so genotipsko zelo raznolike, kar se kaže tudi v variabilnih hranilnih vrednostih njihovih listov. Kakovost listov vpliva na razvoj, imunske in protibakterijske odzive sviloprejk. Namen raziskovalnega projekta je prepoznati, katere bakterije sodelujejo pri boleznih sviloprejk in natančno opisati znake bolezni in lezij. Na območju Slovenije in Madžarske je bilo svilogojstvo prisotno več stoletij, a je pred nekaj desetletij panoga zamrla in vse, kar je ostalo od nekoč pestre preteklosti je nekaj starih dreves. Namen našega dela je najti in ohraniti ta drevesa ter tudi raziskati prehrambeno vrednost njihovih listov. Sviloprejke bomo izpostavili bakterijam in jih hranili z listi različnih murv. Tako bomo dobili podatke o učinku prehrane na razvoj ličink in na odpornost proti bakterijskim okužbam. Rezultati študije nam bodo dali nova znanja o razvoju bakterijskih bolezni sviloprejk in hranilnih vrednostih listov lokalnih starih murv, ki pa bi jih lahko uporabili za ponovno vzpostavitev svilogojstva kot kmetijske panoge v srednji Evropi.

več na: www.murve.um.si.

Sestava projektne skupine:

Madžarski partner

Vodja projekta: dr. Rebeka Berčič
Department of Microbiology and Infectious Diseases
University of Veterinary Medicine Budapest
Hungária krt. 23-25., 1147 Budapest, Hungary
Ta e-poštni naslov je zaščiten proti smetenju. Za ogled potrebujete Javascript, da si jo ogledate.
Področje: Biotehniške vede, živalska produkcija in predelava

dr. Tamás Bakonyi
Ta e-poštni naslov je zaščiten proti smetenju. Za ogled potrebujete Javascript, da si jo ogledate.
Področje: Biotehniške vede, živalska produkcija in predelava

Slovenski partner

Vodja projekta: dr. Andreja Urbanek Kranjc
Katedra za botaniko in fiziologijo rastlin
Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede
Univerza v Mariboru
Pivola 10, 2311 Hoče, Slovenija
Ta e-poštni naslov je zaščiten proti smetenju. Za ogled potrebujete Javascript, da si jo ogledate.
Področje: Biologija, rastlinska fiziologija

Raziskovalci:

dr. Vesna Bukovac
Ta e-poštni naslov je zaščiten proti smetenju. Za ogled potrebujete Javascript, da si jo ogledate.
Področje: Kemija, analizna kemija

Mateja Felicijan, mag. kmet.
Ta e-poštni naslov je zaščiten proti smetenju. Za ogled potrebujete Javascript, da si jo ogledate.
Področje: Biologija, botanika

dr. Mario Lešnik
Ta e-poštni naslov je zaščiten proti smetenju. Za ogled potrebujete Javascript, da si jo ogledate.
Področje: Rastlinska produkcija in predelava, fitomedicina

dr. Andrej Paušič
Ta e-poštni naslov je zaščiten proti smetenju. Za ogled potrebujete Javascript, da si jo ogledate.
Področje: Biologija, botanika

dr. Stanislav Tojnko
Ta e-poštni naslov je zaščiten proti smetenju. Za ogled potrebujete Javascript, da si jo ogledate.
Področje: Rastlinska produkcija in predelava, kmetijske rastline

Tehnični sodelavci:

Anja Ivanuš, dipl. inž. kmet. un
Ta e-poštni naslov je zaščiten proti smetenju. Za ogled potrebujete Javascript, da si jo ogledate.
Področje: Biologija, botanika

Johannes Rabensteiner, mag. rer. nat.
Ta e-poštni naslov je zaščiten proti smetenju. Za ogled potrebujete Javascript, da si jo ogledate.
Področje: Biologija, botanika

Polona Sušnik, mag. ekol. biod.
Ta e-poštni naslov je zaščiten proti smetenju. Za ogled potrebujete Javascript, da si jo ogledate.
Področje: Biologija, botanika

Bojana Žiberna, univ. dipl. ing. kem. tehn.
Ta e-poštni naslov je zaščiten proti smetenju. Za ogled potrebujete Javascript, da si jo ogledate.
Področje: Kemijsko inženirstvo, procesno sistemsko inženirstvo

Bibliografske reference:

KOREZ, Julija. Morfološka variabilnost listov starih genotipov murv v Vipavski regiji : diplomsko delo. Maribor: [J. Korez], 2016. VII, 27, [5] f., ilustr. https://dk.um.si/IzpisGradiva.php?id=63643. [COBISS.SI-ID 4231724]

UGULIN, Tina. Spremenljivost vsebnosti skupnih proteinov, fenolov in tiolov v listih starih genotipov murv v Goriški regiji : magistrsko delo. Maribor: [T. Ugulin], 2016. VII, 24, [24] barvnih f. pril., ilustr. https://dk.um.si/IzpisGradiva.php?id=60241. [COBISS.SI-ID 4165676]

UGULIN, Tina, BAKONYI, Tamas, BERČIČ, Rebeka Lucijana, URBANEK KRAJNC, Andreja. Variations in leaf total protein, phenolic and thiol contents amongst old varieties of mulberry from the Gorizia region. Agricultura, ISSN 1580-8432. [Print ed.], December 2015, vol. 12, no. 1-2, str. 41-47, ilustr., doi: 10.1515/agricultura-2016-0006. [COBISS.SI-ID 4132652]

URBANEK KRAJNC, Andreja. Črno-bela štorija o murvah. Gaia, ISSN 1408-7774, 2016, letn. 22, št. 12, str. 28-29, ilustr. [COBISS.SI-ID 4266284]